Методы визуализации в микробиологии: микроскопические техники и их применение

Человеческий глаз способен различать объекты величиной около 100 микрометров (мкм). Учитывая, что средний размер микробных клеток составляет 1-4 мкм, увидеть их без специальных оптических приборов людям не дано. Для визуализации микроорганизмов человечество научилось увеличивать их изображение с помощью микроскопов, а процесс изучения формы и структуры таких клеток назвали: микроскопический метод исследования.

Кстати, термин микроскоп еще XVII веке предложил итальянец Фабер: от micros – мелкий и scopeo - смотрю. Он был соратником Галилея, который и изобрел первое такое устройство. Правда, микроскоп Галилея подходил лишь для изучения насекомых, линзы не сильно увеличивали объекты.

Можно ли увидеть микробов в микроскоп? Микроскоп, пригодный для обнаружения крупных микробов, сконструировали голландцы: отец и сын Янсены. Прибор давал увеличение 32 раза. С помощью него ученый Кирхер нашел в гниющих продуктах и в крови больных чумой людей «неких живых существ». Чуть позже микроскоп Левенгука увеличивал изображение уже в 150-300 раз. Рассматривая налет с зубов, кровь и другие объекты, ученый описал неизвестные образования шарообразной, палочковидной и извитой формы. Он дал им общее название “зверушки” или “анималькулюсы” и подготовил не только характеристики, но и зарисовки микроорганизмов. Первым из россиян, кто увидел микробов, был Петр I. Он посетил Левенгука и привез в Россию его прибор.

Сейчас используют разные методы микроскопии в микробиологии: световую, флуоресцентную, электронную и сканирующую зондовую. Каждый из этих методов исследования микрообъектов предоставляет уникальные возможности для визуализации клеток и изучения их морфологии.

Да будет свет!

Какой нужен микроскоп, чтобы увидеть микробов? Световая микроскопия – наиболее доступный и простой метод визуализации клеток. Она позволяет изучать морфологические свойства паразитов, клеток растений и животных, фрагментов насекомых, простейших бактерий, вести подсчет клеток крови, дает возможность выявить локализацию отдельных химических веществ. Световая микроскопия включает в себя следующие разновидности

Светлопольная микроскопия изучает препарат в проходящем свете. Свет от источника собирается и направляется в линзы объектива, где формируется изображение. Максимальное увеличение в 1000-1500 раз, разрешающая способность - 0,2 мкм.

Темнопольную микроскопию применяют, если нужен контраст, но вместо красителя используют конденсатор для формирования «полого» конуса света, который распространяется вокруг объектива. Чем отличается метод темнопольной микроскопии от других методов? Наблюдение в темном поле позволяет увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, но исследовать можно только контуры клеток.

Фазово-контрастная микроскопия в микробиологии построена на изменении световой волны, что проходит через прозрачные бесцветные структуры. При этом живущие клетки можно рассмотреть в их естественном положении. Этот способ предложил физик Фриц Цернике в 1930-е годы, впоследствии изобретение принесло автору Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Чем отличается темнопольный метод от фазово-контрастного?

Темнопольная микроскопия обеспечивает хороший контраст для субмикронных деталей, она регистрирует только рассеянный под большим углом свет. Фазовый контраст используется для неокрашенных и прозрачных биологических образцов, показывая изменения их формы и плотности.

Флуоресцентная (Люминесцентная) микроскопия визуализирует конкретные молекулы или структуры в клетке, используя флуоресцентные маркеры или антитела, т.е. наблюдая  свечение микрообъектов при освещении их ультрафиолетовыми лучами.

Поляризационная микроскопия применяется для обнаружения и изучения объектов или их структур, обладающих свойствами анизотропии или двойного лучепреломления (миофибриллы, волокна соединительной ткани, кристаллические структуры)

Смотря как посмотреть

Для различных нужд создаются световые оптические системы различной конструкции.

Прямой микроскоп встречается чаще всего. Он используется при изучении прозрачных и полупрозрачных микрообъектов, сопоставимых с клетками. Лабораторные микроскопы особенно широко применяются в ботанике, микробиологии, цитологии и медицине.

В микроскопе с инвертированной схемой объективы находятся под исследуемым предметом. В зависимости от назначения и особенностей конструкции, инвертированные микроскопы могут быть биологическими, люминесцентными, металлографическими и др. Они широко используются в научных и лабораторных исследованиях.

Стереоскопические или стереомикроскопы обладают большей глубиной резкости, их применяют для изучения относительно крупных и выпуклых микрообъектов – таких как части растений, грибов, колонии микроорганизмов.

Световой микроскоп – это незаменимый инструмент. Он прост, доступен и компактен. Современные модели позволяют выводить изображение на экран компьютера и делать фото и видео. 

Что видно в световой микроскоп?

• В растительной клетке: клеточную стенку, хлоропласты, ядро, вакуоли.
• В животной клетке: ядро, митохондрии.
• У бактерии: форму и подвижность. 

Электроны на службе!

Электронная микроскопия работает с помощью пучка электронов и позволяет получать изображения с очень высоким разрешением. Пучок электронов создаётся системой электромагнитов из электронов, выходящих из металла вследствие его высокотемпературного нагрева. Вместо стеклянных линз в электронном микроскопе используются электромагнитные поля.

Сегодня в клинических и биомедицинских исследованиях используются два основных типа электронных микроскопов: просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) и сканирующий электронный микроскоп (СЭМ ); иногда ПЭМ и СЭМ объединяются в одном приборе — сканирующем просвечивающем электронном микроскопе (СТЭМ).

Трансмиссионная (просвечивающая) микроскопия изучает ультратонкий срез образца ткани в пучках электронов, которые в условиях высокого напряжения (40-100Кв) и глубокого вакуума излучает электронная пушка. Электронная линза здесь и конденсор, и объектив, и проектор. Изображение формируется на флюоресцирующем экране и регистрируется в цифровом формате. Максимальное увеличение для срезов ткани до 150 000 раз, разрешающая способность – 1-2 нм.

Сканирующая электронная микроскопия исследует поверхность объекта электронным пучком. Вторичные электроны фиксируются детектором и формируют трехмерное изображение на дисплее микроскопа. Максимальное увеличение до 20 000 раз, разрешающая способность – 3-10 нм.

Каковы области применения электронной микроскопии?

В биологических науках электронная микроскопия может использоваться для изучения молекулярной природы и механизмов заболеваний, наблюдения за трехмерной структурой биологических тканей или клеток, определения структуры белков и наблюдения за вирусами в биологическом контексте.

Чем отличается световой микроскоп от цифрового?

Оптический микроскоп позволяет наблюдать только крупные органоиды: пластиды и ядро клетки. Электронная же микроскопия дает возможность изучать совсем малые органоиды: митохондрии, рибосомы, а также отдельные структуры цитоплазмы (эндоплазматическую сеть, аппарат Гольджи). С помощью цифрового микроскопа можно увидеть бактерию и детально изучить ее внутреннюю структуру. Из-за крайне малого размера вирусов (обычно 20–300 нм) классическая световая микроскопия недостаточна, поэтому используются более совершенные методы. Сила увеличения электронного микроскопа достигает 300 000 раз.

Недостатки электронного микроскопа:

• сложность использования;
• невозможность исследовать живые объекты;
• необходимость в дополнительном оборудовании;
• черно-белые изображения;
• риск утечки радиации.

Визуализируй всё! Как еще?

Световая и электронная микроскопия – не единственные методы исследования.

Конфокальная микроскопия использует пространственную фильтрацию для устранения света вне фокуса и вспышки в образцах, которые толще плоскости фокусировки. Нужное освещение достигается путем сканирования одного или нескольких фокусированных лучей света, обычно от лазера.

Мультифотонная микроскопия подходит для изучения срезов мозга, эмбрионов. Метод схож с конфокальным и обеспечивает условия для трехмерной визуализации, но более эффективен благодаря ряду преимуществ:

1. Благодаря меньшему поглощению тканей и клеток области по сравнению с УФ, уменьшается повреждение живых клеток фотоиндуцированными процессами.
2. В результате достигается большая глубина проникновения излучения в биологические объекты.
3. Отсутствует возбуждение и выцветание флуорохромов вне фокального микрообъема, поэтому конфокальная диафрагма не требуется.

Микроскопия с помощью атомной силы (атомно-силовая микроскопия (АСМ, AFM — Atomic Force Microscopy) – это высокоразрешающий метод сканирующей зондовой микроскопии, который позволяет исследовать рельеф поверхности материалов и их физико-химические свойства на микро- и наноуровне. В результате получается трехмерное изображение поверхности с разрешением от десятков ангстрем вплоть до атомарного (0,1–1 нм по горизонтали и 0,01 нм по вертикали). 

Микроскопия с помощью атомной силы может происходить в контактном, бесконтактном и прерывистом режиме, чтобы исследовать как твердые, так и очень хрупкие образцы в вакууме, на воздухе и в жидких средах (включая биологические образцы).

Для чего же нужна микроскопия? Что изучает микроскопический метод?

Микроскопия – это быстрый метод диагностики инфекционных заболеваний. Он обнаруживает возбудителей (бактерии, грибы, простейшие) в биоматериале (мазки, соскобы, жидкости) по их форме и окраске. При этом микроскопия не только выявляет возбудителя, но и оценивает реакцию организма на него (уровень лейкоцитов).  Микроскопия позволяет проследить весь цикл репродукции вируса, исследует его взаимодействие с клетками-хозяевами.

Изучение морфологии бактерий, архей, грибов, образующих микробные сообщества, позволяет не только определить форму, размер, взаимодействие и взаимное расположение микроорганизмов, но и внутреннюю структуру клеток. Это позволяет исследователям получать новые знания о клеточных процессах и их регуляции, а также разрабатывать новые подходы к диагностике, лечению и предотвращению различных заболеваний. Что такое тинкториальные свойства бактерий? Это способность микроорганизмов окрашиваться определенными красителями (основными или кислыми) в различные цвета. Эти свойства зависят от химического состава и структуры клеточной стенки, что позволяет морфологически идентифицировать бактерии, разделяя их на группы (например, грамположительные и грамотрицательные). Определение тинкториальных свойств является ключевым этапом в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Постоянное совершенствование и развитие методов визуализации клеток и их структур играют ключевую роль в развитии современной медицины и биологии, развиваются новые виды микроскопии в микробиологии. 

Формирование оптического изображения – первый шаг к анализу данных. Микроскоп выполняет этот шаг в сочетании с электронными детекторами, процессорами изображений и устройствами отображения, которые можно рассматривать как расширение системы формирования изображения. Компьютеризированное управление фокусом, оптическими компонентами, фильтрами и детекторами позволяет проводить высокоточные исследования. Возрастающее применение электрооптики в микроскопии дает импульс к созданию дополнительных инструментов, способных манипулировать субклеточными структурами или частицами, изображениями отдельных молекул и широким спектром сложных спектроскопических приложений.


Больше о микробиологии и других направлениях в медицине вы можете узнать из наших курсов.